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通常，在科學實驗中，我們會對所研究的目的基因進行表達分析，常用的方法有實時熒光定量PCR法（qRT-PCR）。有些做RNA-seq的小伙伴，在做完轉錄組分析之后，一般也都會要求做qRT-PCR來驗證二代測序得到的轉錄本表達是否可靠。這里我們講一下常用的Livak法(2^-??Ct法)是如何計算的，以及在qRT-PCR中常見問題和解決方案。

【資料圖】

qRT-PCR的原理：

以基因的cDNA為模板進行PCR擴增，在PCR擴增過程中，熒光信號的強度與擴增產(chǎn)物的數(shù)量成正比。通過實時檢測PCR擴增過程中熒光信號的變化，可以獲得關于相對定量基因表達水平的信息。qRT-PCR一般包括SYBR染料法和Taqman探針法。例如，SYBR染料游離時發(fā)出的熒光信號微乎其微，但當其與雙鏈DNA的小溝結合后，熒光信號強度會大大增加，表明雙鏈DNA總量也發(fā)生了很大變化。在qRT-PCR實驗中，Ct值表示每個反應管內(nèi)的熒光信號達到預設閾值的周期數(shù)（cycle）。

擴增曲線及溶解曲線如下圖所示：

擴增曲線主要用于評估擴增引物的效率。當使用引物特異性較好時，擴增曲線呈現(xiàn)出單一峰值，這樣的實驗結果更加可靠。

一、Livak法的詳細步驟：

在這里，我們有一個對照組（wt），一個處理組（mut），還有一個內(nèi)參基因（ATCB）和目的基因（OCA2），希望比較處理組與對照組中目標基因的相對表達差異，也就是計算2^-??Ct，數(shù)據(jù)如下圖所示：

1.?計算每個組內(nèi)參基因（ATCB）Ct值的均值

2.?計算每組中待檢目的基因的Ct值與內(nèi)參基因的Ct值之差（即?Ct）

3.?計算對照wt組中?Ct值的均值，然后將處理mu組中每個樣本的?Ct值減去對照wt組的?Ct 均值，以得到??Ct值

4.?進行相對表達量計算，即將處理mu組相對于對照wt組的??Ct值作為指數(shù)，并計算2的負冪次方（2^-??Ct）

二、常見問題和解決方案：

1、擴增曲線中Ct值出現(xiàn)過晚

① cDNA模板降解或cDNA模板濃度低：Ct值越晚，表示內(nèi)參基因和目的基因序列起始濃度越低?？梢灾匦轮苽鋍DNA模板重復實驗，以及減少cDNA模板稀釋倍數(shù)重復實驗。

② 擴增效率低：引物或探針的設計可能特異性不強，導致擴增效率低。確保引物或探針的設計準確，避免與非目標序列的非特異性結合?？梢灾匦略O計引物或者優(yōu)化PCR反應條件，比如在qRT-PCR中使用三步法擴增程序。

③ PCR體系中存在抑制物：樣品中可能存在PCR反應抑制物，如殘余酚類物質(zhì)、碳水化合物、鹽（胍鹽）等。這些抑制物可能會降低PCR效率，導致Ct值偏高。一般來說，純度好的RNA，A260 / A280比值應大于，如果比值低于，則表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。確保在樣品制備過程中使用純凈的試劑和采用可以提取高質(zhì)量RNA的方法，以去除或稀釋潛在的抑制物。

2、在qRT-PCR實驗中，內(nèi)參基因的Ct值正常，而目的基因的Ct值出現(xiàn)較晚

① 目的基因的表達水平較低：如果目的基因的表達水平較低，PCR擴增需要更長的時間才能達到設定的熒光閾值，因此Ct值會出現(xiàn)較晚。在這種情況下，為了準確測量目的基因的表達水平，內(nèi)參基因的模板和目的基因的模板應該分開進行稀釋（內(nèi)參基因和目的基因都有其特定的濃度范圍，過低或過高的濃度都可能導致結果的不準確性）。也可以使用數(shù)字PCR儀檢測。

② PCR擴增得率低：引物和目的基因序列之間的特異性匹配可能存在問題，導致擴增效率低?？梢栽O計多對引物，從中選擇最優(yōu)的。

3、熔解曲線呈現(xiàn)非單一峰

① 非特異性擴增：當PCR反應條件不夠好或引物與非目的基因序列匹配時，可能會導致非特異性擴增產(chǎn)物的形成。這種情況下，熔解曲線可能顯示出多個峰?？赏ㄟ^優(yōu)化PCR反應條件（進行溫度梯度PCR實驗，嘗試不同溫度和延伸時間）、根據(jù)引物設計原則來設計新的引物等方法以增加特異性。

② 引物二聚體：引物對之間的非特異性結合，導致在熔解曲線上出現(xiàn)額外的峰，通常位于75℃左右。在qRT-PCR反應結束后，可以通過瓊脂糖凝膠電泳確認引物二聚體?？梢酝ㄟ^適當減低引物濃度以避免。

③ 在qRT-PCR中有基因組污染：重新制備cDNA模板即可

4、實驗重復性很差

① 移液槍不準，加樣不準確：這種情況下，可以更換最佳使用量程的性能更好的移液槍，并定期對移液槍進行校準。

② 定量PCR儀在不同位置溫度不一樣：為獲取準確的實驗結果，定量PCR儀應定期進行校準。

③ qRT-PCR預混液未混合均勻：可以輕輕顛倒裝有qRT-PCR預混液的離心管來促進混合。注意應避免劇烈搖動或振蕩，以免引起氣泡的形成。

以上提供的是qRT-PCR相對定量分析的詳細步驟以及常見問題和解決方案，希望能對小伙伴們有所幫助！關注漢恒生物，如果您對于qRT-PCR實驗還有任何疑問，都可以跟我聯(lián)系！

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